正常细胞中的磷脂酰丝氨酸(PhosphatidylserinePS)位于细胞膜的内侧在细胞发生凋亡时PS会从细胞膜内侧翻转到细胞膜表面即暴露在细胞的外环境中。Annexin-V是一种分子量在35~36KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白与PS有极高高亲和力可以与之发生特异性结合将Annexin-V进行荧光素(FITC)标记成Annexin-V. FITC探针用该探针标记待检测细胞利用流式仪通过检测FITC信号即可反应带警车细胞的凋亡情况。
当然对于现有的凋亡检测试剂并没有满足于整体调亡情况的反映一般的试剂会结合碘化丙啶(propidineiodide.PI)进行更细层面的检测。PI是一种核酸染料它不能透过完整的细胞膜但在调亡中晚期的细胞和坏死细胞细胞膜一般会发生破裂此时PI能够细胞膜进入到细胞核内嵌入到DNA中使细胞核释放红色荧光。
在操作过程中不论是分离组织细胞或是收集培养中的细胞需尽量避免污染一般收集1*106的细胞制备成1mL的细胞悬液按照凋亡检测试剂盒说明书进行操作即可但一定要注意整个过程需要轻柔操作以免造成细胞是写损伤而影响检测结果。探针孵育完成后需在1小时以内完成检测另外上机检测时记得配上不做任何标记的阴性对照管哦。
对于实验结果首先我们需要在细胞自身光散射特性方面进行评判。调亡细胞形态上的改变影响它们的光散射特性。在流式细胞仪上前向散射光与细胞的大小有关而侧向散射光反映的是光在细胞内的折射作用与细胞内的颗粒多少有关。在细胞凋亡时细胞固缩体积变小故前向散射光降低这一特性往往被认为是凋亡细胞的特点之一。此外细胞调亡时由于染色体降解核破裂形成细胞内颗粒往往增多故凋亡细胞侧向散射光常增加。细胞坏死时由于细胞肿胀其前向散射光增大侧向散射光在细胞坏死时也增大因此可根据前向散射光和侧向散射光区别调广细胞和坏死细胞。但需要注意的是根据前散射光和侧向散射光判断凋广细胞的可靠性受被检测细胞形态上的均一性和核胞浆比率影响很大。因此我们必须要进行调亡因子的直接反映。
前面我们提到凋亡中晚期的细胞和坏死细胞由于其细胞膜损伤Pl能够穿透细胞膜而嵌入DNA中是细胞核产生红色荧光。而细胞膜保持完好的早期凋亡细胞对于细胞活性鉴定的染料PI有抗染性则不会有红色荧光产生正常活细胞与之相似。在双变显流式细胞仪的散点图上所呈现的结果即为左上象限显示机械损伤细胞为(FITC-/PI+)左下象限显示活细胞为(FITC-/PI-)右上象限是非活细胞即坏死细胞或晚期凋亡细胞为(FITC+/PI+)而右下象限为早期调亡细胞呈现(FITC+/PI-)。
最后提醒一下想要做流式凋亡检测结果统计的科研汪们由于用流式检测凋亡时PI受时间的影响很大,因为标记了PI后会加大细胞毒性随着时间延长会导致PI的染色增加特别是检测早期凋亡时,如果时间延长除了会导致在流式细胞仪上的细胞分群差距加大外误差会明显加大。根据以前做流式凋亡时的经验建议每组实验一次可以先做三个复孔上机前5分钟加Pl最好在半小时内检测完毕。这时可以先分析下三个复孔的差异。等待摸索的实验条件成熟后每组实验一次可以做6~8个复孔然后做统计学分析。严格说来当做出统计学差异时这样的实验还要重复三次。但是因检测凋亡时，受细胞状态PI染色时间，流式检测时间,以及每次实验时的误差等的影响外很难保证能够完全重复出上次的结果甚至即使在保证了实验条件几乎相同的情况下每次重复的差异也会中现加大的情况。这时可以话当重复2~3次尽量使差异减小。
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